Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos produtos de digestão
por enzima de restrição
|
Pode ser facilmente observado, nos dois primeiros
géis, que o DNA total dos organismos do gênero Acanthamoeba
clivado por enzimas de restrição se apresenta formando um
padrão de fragmentos visíveis em transiluminador com luz
ultravioleta (gel corado com brometo de etídio). Isso denota a natureza
repetitiva do genoma destas amebas. Normalmente, o DNA total de eucariotos
clivado por tais enzimas resulta em um "escorrido" no gel, resultado da
presença de grande quantidade de fragmentos com tamanhos contíguos,
mas com baixo número de cópias para cada tamanho, dando a
impressão de continuidade. Quando um fragmento de determinado tamanho
tiver um número muito grande de cópias, este aparecerá
no gel como uma banda brilhante, como ocorre também, embora não
tão proeminentemente, com DNA de levedura, outra exceção
entre os eucariotos.
|
| Como a clivagem resulta em um padrão de fragmentos
(conhecido por RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) com várias
bandas visíveis sem a necessidade de se fazer a hibridização,
tem-se a possibilidade, ao menos teórica, de identificar e agrupar
certos isolados uns com os outros com base no padrão apresentado
após reações com diversas enzimas de restrição
(no nosso caso, sete: EcoRI, HindIII, BglII, HincII,
MspI, HhaI e HaeIII). Isso se baseia na premissa de
que quanto mais semelhantes os padrões entre dois isolados, maior
será a identidade genética entre eles (ver refs22,.23).
A lógica por trás disso é que, havendo mais sítios
de restrição em comum, portanto menos substituições
de base ocorrendo desde a separação dos isolados, então
eles estarão mais próximos entre si, filogeneticamente, do
que isolados com padrões com poucos fragmentos em comum. Esta é
a base teórica para a determinação de relações
de parentesco que desejamos fazer neste trabalho. Por vezes, o resultado
pode ser diferente entre duas enzimas utilizadas, por isso é necessário
utilizar várias e depois fazer um consenso de maioria para se determinar
as relações, com maior nível de confiabilidade. Além
disso, estamos procedendo à hibridização dos southern
blots destes géis com sondas de 18S obtidas em nosso laboratório
por meio de PCR (para maiores detalhes, ver ref.1),
e ao uso do RAPD (esta técnica a cargo de Cléber X. de Gusmão,
deste laboratório) para melhor corroborar os resultados de RFLP.
|
Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos produtos de digestão
por enzima de restrição
|
